培养细胞的冷冻保存与复苏

 


n       概述 ²      冻存过程
n       冷冻保存与复苏的原理 ²      冻存结果
¨      冷冻速率 ²      讨论
¨       冷冻保存温度 n       冻存细胞的复苏
¨       复温速率 ¨       非玻璃化冻存细胞的复苏
¨       冷冻保护剂 ²     主要材料
n       冷冻保存方法 ²      复苏过程
¨      非玻璃化冻存方法 ²      结果
²     主要材料 ²      讨论
²      冻存过程 ¨       玻璃化冻存细胞的复苏
²      冻存结果 ²      主要材料
²      讨论 ²      复苏过程
¨       玻璃化冻存方法 ²      结果
²     主要材料 ²      讨论
  
n       概述 
Spallanzani(1776)最早发表了冷“处理”对“细胞”生命活动影响的报道,他用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后,再将玻璃瓶放回室温下,发现了一个令人惊奇的现象,那些原本已经不动了的精子又“复活”了,就好象是刚从输精管排出来的一样,冷处理延长至数十分钟,情况依然如此。于是,他认为冷不能杀死精子。大约100年以后,许多早期的学者重复了低温处理对精子活动的影响,同样得出了相似的结论。到1900年前后,科学家基本上肯定了生物成分(如精子和一些生物化学物质)能够在零下温度贮存的事实。 
Shettles(1940)证明人类的精子也能抵抗温度的突然变化,他将人的精液封闭在小管内,在-790C~-1960C之间的低温条件下进行冷处理,发现有10%的精子仍然能够存活。此后,冷冻处理研究材料的范围大大拓展。 
Polge等人(1949)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,他们仍然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是,电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及Smith(1961)等学者的继续和发展。 
1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock(1959)等人发现了一种新的化学保护剂,这就是人们熟悉的二甲基亚砜(DMSO)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 
  冷冻保存与复苏原理 
在低于-700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。因此,采取适当的方法将生物材料降至超低温,即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时,其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存,就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-700C的超低温条件),并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存,并在适当条件下复苏。 

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